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原位杂交
             荧光原位杂交(FISH

 一、           组织标本的准备

组织标本经甲醛固定24-48h,常规脱水、透明、浸蜡和包埋;4μm石蜡切片,贴在涂有APES胶的干净载玻片上。58℃烤8-24h。ISH试剂的配制(所有试剂和用具均用DEPC水处理)。

二、操作流程: 

一、杂交片的前处理

1、常规脱蜡至水。

20。01mol/L,pH8。0 EDTA(0.02 mol/L,pH8.0TB配制)  98℃ 煮 15min;

3、自然冷却 15min,蒸馏水洗2-5min;

42μg/ml蛋白酶K(TE配制) 室温 4min, 0.1mol/L甘氨酸PBS10min.

5、蒸馏水洗2-5min;

675%,85%,95%,100%酒精系列脱水各1min

二、杂交

将荧光标记探针加入48ulRNAas PBS溶解,用杂交液(4×SSC,25%去离子甲酰胺, RNAas PBS1:200稀释,20ul杂交液并覆盖,55℃杂交90min, 37℃杂交:24h

三、杂交后洗涤(洗涤过程应避光)

(1)将切片浸入杂交后洗涤缓冲液的洗缸中72 30min(洗缸应提前30min放入72水浴锅内预热到72,2×10min。

★杂交后洗涤缓冲液:2×SSC/0。3% NP-40

20×SSC pH5.3            100ml

蒸馏水                        847ml

NP40                           3ml

最后体积                     1000ml

1N NaOHpH7。0-7。5

(2)2×SSC.0.3% NP-40733min

0.4×SSC.0.3% NP-40733min

70%乙醇洗 1min

(3)每片滴加10μl  DAP1(4,6 diamidino-2-phenylinodole)封片衬染5min。

(4)不及时观察,可将切片保存在-20冰箱暗处,观察时复温至室温即可。